Izozte-urtze ziklo bidezko mintz-ereduen fusioa

Abstract

Mintz ereduak, bai zelularen, baita zelularen organuluen arkitektura, imita dezaketenez, proteina-lipido elkarrekintzak, geruza bikoitzean txertatutako proteinen egiturak edota mintzen dinamika ikertzeko erabilgarriak izan daitezke. Gainera, mintz ereduen diseinu kontrolatu bat egiteko aukera existitzen denez, beraien konposizio fisiko-kimiko eta tamaina jakineko egitura lipidikoak sortuz, hauek izan ditzaketen erabilerak gero eta ugariagoak izaten ari dira, horien artean aurkitzen dira hain zuzen ere fusio prozesua ikertzeko entseguak. Jakina da, zeluletan fusioa oso prozesu garrantzitsua dela; espermatozoideek burutzen duten obuluaren ernalketa, exozitosi konstitutibo eta arautua edota organuluen biogenesia esaterako, fusio prozesuetan oinarritzen dira. Ikerketa honetan, izozte-urtze ziklo bidezko mintz ereduen fusio kontrolatu bat burutzeko teknikaren efikazia neurtu da. Tamaina (SUV, LUV eta MLV) eta konposizio molekular ezberdineko (fosfatidilkolina edota fosfatidilkolina, esfingomielina, fosfatidiletanolamina eta kolesterol kantitate ezberdineko) mintz ereduak erabili dira. Fusio maila erresonantzia bidezko energia transferentzia (FRET) izeneko teknikaz neurtu da, honetarako NBD-PE eta Rho-PE markatzaile fluoreszenteak mintz ereduetan txertatuak izan direlarik. Horrela ba, ikerketa honetan, saiakuntza mota hauetan erabili beharko litezkeen mintz eredu eta lipido mota egokienak, markatzaile fluoreszente kantitate eta izozte-urtze ziklo kopuru optimoa eta fusio osteko egitura lipidikoen morfologia ikertu dira. Azkenik, teknika hau GUV izenez ezagutzen diren mintz ereduak sortzeko baliogarria izan daitekeela frogatu da; Model membranes are models that somehow mimic natural biomembranes. They have being widely used for investigating many cell events as protein-lipids interaction, the architecture of proteins embedded in the membranes or the membrane dynamic. In addition, the design of model membranes can be controlled in order to form specific physicochemical composition and size structures. It is known that the fusion process is very important in the cell; the fertilization of an ovule by a sperm, the constitutive and regulated exocytosis and the biogenesis of organelles are some clear examples of this. In the present study, we try to measure the efficacy of a freeze-thawed mediated fusion process. We have used lipid membranes of different sizes (SUV, LUV and MLV) and compositions (phosphatidylcholine or different amounts containing phosphatidylcholine, sphingomyelin, phosphatidylethanolamine or cholesterol). The fusion efficacy has been measured by fluorescence resonance energy transfer (FRET) experiments. NBD-PE and Rho-PE fluorescent probes have been inserted in model membranes for this purpose. We have proved which would be the best type of model membrane, its lipid composition, the fluorescence percentage needed and the required freeze-thawed cycle number to obtain the optimal fusion results. Finally, we have studied the morphology that the lipid structures confer after the fusion process, concluding that this technique can be useful for the synthesis of the GUV called model membranes.