Elucidating Angelman syndromes,s molecular mechanisms by identifying the substrates, interactors and counteracting DUBs of UBE3A

Abstract

Tesi honetan, aurretiaz Drosophila melanogaster eulian eta saguetan identifikatutako UBE3Aren balizko substratuak balioztatu ditugu, horretarako moldatutako purifikazio estrategia bat erabiliz ¿GFP pull-down estrategia¿. Halaber, estrategia hori masa espektrometriarekin konbinatuz UBE3Ak edozein substratutan sortutako ubikitina kate-motak eta substratu horien ubikitinazio-guneak identifikatzeko baliogarria dela egiaztatu dugu. Horrez gain, giza deubikitinasa (DUB) ezberdinak testatu ditugu, eta USP9X identifikatu dugu UBE3Aren aurkako funtzioa burutzen duen DUB gisa. USP9Xren inhibizioak UBE3Aren substratu den DDI1 proteinaren ubikitinazioa emendatzen du. Era berean, Angelman sindromearen modelo diren eulien fenotipoa ere hobetzen du, eta horrek, etorkizunean ASrentzako tratamenduak garatzen lagundu dezake. Inhibitzaile horren ondorioz, ubikitinazio-maila aldatzen duten, eta beraz, eulien fenotipoa hobetzearen eragile izan daitezkeen proteinak identifikatu ditugu masa espektrometrian oinarritutako esperimentu baten bidez. UBE3Arekin elkarrekin eta ligasaren funtzioa erregulatu dezaketen hainbat proteina ere identifikatu ditugu, baita proteina horiek UBE3Aren amino muturrarekin, karboxilo muturrarekin edo proteina osoarekin elkarrekiten duten zehaztu ere. Azkenik, UBE3Aren egitura osoa definitzeko helburuarekin, ligasa modu eraginkorrean purifikatzeko protokoloa ezarri dugu, eta UBE3A gainadierazten duten saguen portaera ikertu dugu.