Free and extracellular vesicle-associated microRNAs from endometrial fluid as noninvasive diagnostic biomarkers of implantative endometrium

Abstract

Reproducción asistida. Se trata de un proceso complejo, que requiere una sincronía entre el desarrollo delembrión y el endometrio, pero también, una adecuada comunicación entre ambos. Los microRNAs(miRNAs) y las vesículas extracelulares (VE) del fluido endometrial (FE) se han descrito comomediadores de la comunicación embrión-endometrio. Creemos que el análisis de miRNAs libres yasociados a VE del FE podría proporcionar una técnica no-invasiva para reconocer un endometrioimplantativo. El objetivo es definir un método no invasivo que sea sencillo, sensible, reproducible y queademás permita la rápida identificación de un endometrio implantativo mediante el análisis de miRNAs.Hemos comparado cinco metodologías diferentes, dos de ellas consistían en una extracción directa deRNA mientras que las otras tres tenían un enriquecimiento en VE antes de la extracción de RNA. Se llevóa cabo una small RNA-seq para determinar el método más eficiente y encontrar un modelo predictivopara diferenciar entre endometrio implantativo y no-implantativo. Los modelos se confirmaron medianteqPCR en dos conjuntos de muestras, cohorte de descubrimiento (n=30) y de validación (n=60). Nuestrosresultados mostraron que los protocolos de enriquecimiento de VE permiten detectar un mayor númerode miRNAs. Además, obtuvimos dos modelos predictivos basados en tres miRNAs que permitendiferenciar entre endometrio implantativo y no-implantativo. Este estudio introduce nuevos protocolospara analizar miRNAs libres y asociados a VE a partir de volúmenes muy pequeños de FE, que podríanimplementarse en la práctica clínica para la evaluación del estado del endometrio utilizando biomarcadores no invasivos basados en miRNAs. Lo que permitiría planificar la transferencia embrionaria evitando la perdida de embriones cuando se trasfieren a un endometrio que no esta implantativo.

Increasing embryo implantation rates is one of the greatest challenges of assisted reproductiontechniques. It is a complex process that requires synchrony between embryo development and theendometrium, but also adequate embryo-endometrium crosstalk. MicroRNAs (miRNAs) and extracellularvesicles (EVs) in the endometrial fluid (EF) have been described as mediators of embryo-endometrialcommunication. We believe that the analysis of free and EV-associated miRNAs from the EF couldprovide a non-invasive technique to recognize an implantative endometrium. The aim is to define a noninvasivesimple, sensitive, reproducible method that allows rapid identification of an implantativeendometrium by miRNA analysis. We compared five different methodologies, two of them consisted of adirect RNA extraction while the other three had an enrichment in EV before RNA extraction. A smallRNA-seq was performed to determine the most efficient method and to find a predictive model todifferentiate between implantative and non-implantative endometrium. The models were confirmed byqPCR on two sets of samples, discovery (n=30) and validation (n=60) cohorts. Our results showed thatEV enrichment protocols allow detection of a higher number of miRNAs. In addition, we obtained twopredictive models based on three miRNAs that allow differentiation between implantative and nonimplantativeendometrium. This study introduces new protocols to analyze free and EV-associatedmiRNAs from very small volumes of EF, which could be implemented in clinical practice for theassessment of endometrial status using non-invasive miRNA-based biomarkers. This would allow theplanning of embryo transfer avoiding the loss of embryos when they are transferred to a non-implantativeendometrium.