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dc.contributor.advisorOrbea del Rey, Amaia
dc.contributor.authorLacave Lena, José María
dc.date.accessioned2018-04-16T08:38:07Z
dc.date.available2018-04-16T08:38:07Z
dc.date.issued2016-10-05
dc.date.submitted2016-10-05
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10810/26313
dc.description350 p.es_ES
dc.description.abstractLas nanopartículas (NPs) son un tipo de nanomateriales caracterizados por poseer al menos dos de sus dimensiones externas entre 1 y 100 nm. Aunque las NPs han estado presentes en la naturaleza desde siempre debido a erupciones volcánicas, incendios, etc., es durante las últimas décadas cuando se ha producido un incremento sustancial de la presencia de NPs manufacturadas. Estos materiales presentan una serie de propiedades físico-químicas, así como una reactividad química que las hacen sustancialmente diferentes de las mismas sustancias en forma masiva. Entre las NPs procesadas, las NPs metálicas y aquellas que contienen metales, incluyendo óxidos de metales, han causado un especial interés por el amplio abanico de aplicaciones en las que se pueden utilizar.En los últimos años se ha observado un incremento en el uso de NPs manufacturadas en productos de consumo diario, así como en procesos industriales, lo que da lugar a la generación de residuos que, directa o indirectamente, acaban en el medio acuático. Las características físico-químicas y el comportamiento de las NPs se pueden modificar una vez que éstas entran en el medio ambiente dependiendo de las características del medio receptor (pH, fuerza iónica, etc.), o verse afectadas por procesos de oxidación, disolución, etc.La presencia de NPs en los ecosistemas acuáticos puede provocar una gran variedad de efectos tóxicos en organismos, que a largo plazo podrían repercutir en la salud humana. La ruta de entrada de las NPs en los organismos depende de su hábitat. En peces, las NPs se adsorben directamente a la piel, escamas o aletas especialmente en aquellas zonas recubiertas de sustancias mucosas. También pueden entrar a través del sistema respiratorio, ya que las branquias de los peces están en constante contacto con las NPs presentes en la columna del agua. Otra ruta de entrada importante es a través de la dieta, ya sea por la ingesta de partículas suspendidas en el medio o por el consumo de organismos previamente expuestos a las NPs (biomagnificación a través de la cadena trófica).El pez cebra (Danio rerio) se ha erigido como organismo modelo para analizar el efecto tóxico que produce la exposición a NPs en organismos acuáticos, debido a las ventajas que presenta para su uso en el laboratorio: tamaño pequeño en edad adulta, fácil mantenimiento, facilidad de observación y manipulación, y la posibilidad de mantener un gran número de individuos en instalaciones relativamente pequeñas y económicas. Una hembra de pez cebra puede llegar a poner entre 200-300 huevos semanalmente.Los huevos son fertilizados externamente y tiene un desarrollo embrionario muyrápido (2-4 días). Además, hasta las primeras fases larvarias son transparentes, lo quepermite la observación directa de cualquier alteración en el desarrollo sin necesidad demanipularlo.La hipótesis que se pretende demostrar en este trabajo es que la exposición a NPsmetálicas (o que contienen metales) puede provocar efectos tóxicos en embriones depez cebra y estos efectos varían dependiendo de las propiedades físico-químicas de lasNPs y podrían diferir de los efectos provocados por otras formas del mismo metal.Además, la exposición a NPs a través de distintas rutas, puede provocarbioacumulación y efectos tóxicos en peces cebra adultos relacionados con el estrésoxidativo, la genotoxicidad o daños a diferentes niveles de organización biológica quese pueden analizar usando una batería de biomarcadores desde el nivel molecularhasta el nivel tisular.Para comprobar esta hipótesis se llevaron a cabo una serie de estudios que sedescriben en los capítulos que conforman la sección de Resultados y Discusión.En el Capítulo I, se realizó un estudio de la toxicidad aguda de una batería de NPsmetálicas con diferentes características de composición química, tamaño, forma ypresencia de aditivos y se comparó con la toxicidad las formas iónicas y masivas de losmismos metales, así como con la de los aditivos presentes en las soluciones. Para ellose utilizó el test de toxicidad aguda a 120 horas con embriones de pez cebra deacuerdo al protocolo estandarizado de la OECD (TG236) que es un método alternativoa la experimentación con animales. Se midió el efecto sobre la supervivencia, laeclosión (porcentaje y tiempo al que se produce), o la prevalencia de malformaciones.Se testearon cinco tipos de NPs: NPs de Ag cubiertas de maltosa de 20, 40 y 100 nm,NPs de Au estabilizadas con citrato de sodio de 5, 15 y 40 nm, NPs de CdS de ~4 nm,NPs de ZnO de <130 y <280 nm y NPs de SiO2 de 15, 30 y 70 nm. Además, se utilizaronNPs fluorescentes de SiO2 de 30 nm para estudiar la interacción entre las NPs con losembriones y el papel protector del corion durante las primeras horas de desarrollo. LasNPs solubles (Ag, CdS, ZnO) resultaron las más tóxicas, con valores de LC50 tan bajoscomo 0.529 mg Ag/L para las NPs de Ag de 20 nm y un incremento significativo de laprevalencia de malformaciones en embriones expuestos a 0.1 mg Cd/L de NPs de CdS.En el caso de las NPs insolubles, como el SiO2, no se observaron efectos agudosdurante el desarrollo temprano del embrión debido al efecto protector del corion,aunque se podrían esperar efectos a más largo plazo ya que tras la eclosión seobservaron NPs fluorescentes de SiO2 depositadas sobre las laminillas de la branquia ysu excreción a través del intestino. En otros casos, como en el de las NPs de oro, latoxicidad se pudo atribuir a la presencia de aditivos (citrato de sodio) en la suspensiónde las NPs, el cual provocó una toxicidad similar cuando se testeó por separado. Engeneral, estos resultados indican que la toxicidad depende principalmente de lacomposición química y, por tanto, de la solubilidad de las NPs. Otras características,como el tamaño, juegan un papel secundario. Esta conclusión se basa también en laobservación de que la forma iónica de los metales fue siempre más tóxica que la formanano y la forma masiva fue la menos tóxica para el desarrollo embrionario del pezcebra.Una vez clasificadas las NPs atendiendo a su toxicidad, se seleccionaron dos de las mástóxicas (NPs de Ag de 20 nm y NPs de CdS) para evaluar su toxicidad sobre organismosadultos de pez cebra en comparación con la toxicidad de formas iónicas de los metales.Así en los Capítulos II y III se estudió el efecto de la exposición vía agua durante 21 díasde peces cebra adultos a 10 ¿g Ag/L de NPs de Ag o a la misma concentración nominalde plata iónica. Tras la exposición, los peces se mantuvieron 6 meses en agua limpiapara analizar los posibles efectos a largo plazo o la recuperación de los daños causadospor la exposición. La acumulación de plata se midió a través de análisis químicos en elorganismo completo y la acumulación de metales se detectó específicamente en elhígado y en el intestino por autometalografía. La microscopía electrónica de barrido deemisión de campo que se utilizó para analizar la presencia de plata en las branquias,hígado e intestino corroboró que estos órganos son dianas para la acumulación deplata. El destino subcelular de las NPs de Ag se determinó mediante microscopíaelectrónica de transmisión, detectándose en el citosol de las células epiteliales de laslaminillas primarias de las branquias y en el núcleo y en las mitocondrias de loshepatocitos. Se utilizó una batería de biomarcadores para estudiar los efectossubletales provocados por la exposición a ambas formas del metal. En las condicionesensayadas, no se encontró un efecto evidente en la estabilidad de la membrana de loslisosomas hepáticos, incremento del estrés oxidativo o genotoxicidad, aunque elanálisis histopatológico mostró diversas alteraciones en las branquias.El análisis del transcriptoma completo del hígado mostró que la exposición por 3 días aNPs de Ag alteró significativamente (valor de p ajustado < 0.05) el nivel detranscripción de 219 transcriptos diferentes, mientras que la forma iónica reguló 410transcriptos. Tras 21 días, se observó la tendencia contraria: la forma iónica reguló unmenor número de transcriptos (291), mientras que el efecto de las NPs de Ag fuemucho más marcado, ya que se alteró el nivel de transcripción de 799 transcriptosdiferentes. El análisis Blast2GO mostró que los distintos tratamientos enriquecieron demanera significativa los procesos metabólicos. Además, tras la exposición a las NPs deAg también aparecieron especialmente enriquecidos los procesos relacionados con elsistema inmune o con procesos reproductivos. El análisis de correspondencia separólos cuatro tratamientos, siendo el factor ¿tiempo de exposición¿ el que explicaba lamayor parte de la variabilidad. El análisis funcional evidenció una alteración delmetabolismo energético con la regulación significativa de la¿glicolisis/gluconeogénesis¿ tras la exposición a la forma iónica (3 días) y a las NPs deAg (21 días). Además, el ¿metabolismo del piruvato¿ y la ruta ¿biosíntesis deesteroides¿ se alteraron tras 3 días de exposición a la forma iónica y a las NPs de Ag,respectivamente. Otras rutas KEGG detectadas estaban relacionadas con el daño en el ADN (metabolismo de purinas y de pirimidinas) tras la exposición a plata iónica (3 días) y a NPs de Ag (3 y 21 días). En general, la exposición a ambas formas de plata alteró de manera significativa el transcriptoma hepático del pez cebra, siendo la respuesta a cada compuesto diferente dependiendo del tiempo de exposición. La plata iónica ejerció un efecto mayor en un tiempo de exposición más corto, mientras que las NPs de Ag afectaron tras una exposición más prolongada, pero también se detectaron efectos específicos tras la exposición a NPs de Ag, sugiriendo que la toxicidad de las NPs de Ag no estaría solo relacionada con la liberación de iones de plata, sino también con la forma nanoparticulada.En los Capítulos IV y V se estudió y comparó el efecto provocado en peces cebra adultos por la exposición vía agua a NPs de CdS y a cadmio iónico en las mismas condiciones que en el caso de las NPs de Ag (10 ¿g Cd/L durante 21 días y 6 meses en agua limpia). Se observó mortalidad alta en ambos grupos a partir del cuarto día de exposición y una acumulación significativa de cadmio tras 21 días de exposición. El análisis autometalográfico mostró un mayor número de depósitos negros de plata, indicando una mayor acumulación de metal, en el intestino que en el hígado. En el hígado, la mayor acumulación de metales se observó tras la exposición a cadmio iónico, lo cual puede explicar el mayor daño oxidativo a las proteínas evaluado como alteración de los niveles de ubiquitina libre y carbonilación de actina. Sin embargo, se registró una mayor desestabilización de la membrana lisosómica de los hepatocitos tras la exposición a las NPs de CdS. Mediante microscopía electrónica de transmisión, se detectaron NPs en el citoplasma de células epiteliales de la laminilla secundaria de las branquias, adheridas a la envoltura nuclear y dentro de pequeñas vesículas de la membrana de los hepatocitos. No se detectaron efectos genotóxicos en las condiciones testeadas. Se observó un incremento en la prevalencia de vacuolización en el hígado de animales expuestos y alteraciones histopatológicas relevantes en las branquias, como inflamación, aneurismas y fusión de las laminillas secundarias e hiperplasia de la laminilla primaria, indicando que las branquias son una de las principales entradas de cadmio en el organismo.El análisis completo del transcriptoma hepático reveló que las NPs de CdS regularon de manera significativa 15 y 4128 transcriptos diferentes tras 3 y 21 días de exposición, respectivamente, mientras que la forma iónica reguló 47 y 15802 transcriptos. El análisis de los términos GO mostró que procesos biológicos como la respuesta inmune o la homeostasis mitocondrial de los iones de calcio, componentes celulares como los filamentos intermedios o funciones moleculares tales como las uniones a actina se enriquecieron de manera significativa tras la exposición a cadmio iónico respecto de la exposición a NPs de CdS (test de Fisher). El análisis funcional no detectó rutas KEGG significativamente alteradas tras 3 días de exposición, pero sí tras 21 días. La exposición a NPs de CdS durante 21 días causó un efecto significativo en el sistemainmune y estrés oxidativo, mientras que tras la exposición a la forma iónica del cadmio alteró significativamente rutas relacionados con el daño y la reparación del ADN, así como con el metabolismo energético. El análisis de correspondencia separó los cuatro tratamientos, siendo el tiempo de exposición el factor que explicaba la mayor parte de la variabilidad. En resumen, ambas formas de cadmio ejercieron un fuerte efecto sobre el transcriptoma hepático del pez cebra tras una exposición a medio plazo, siendo los efectos provocados en el hígado del pez cebra diferentes dependiendo de la forma del cadmio a la que se les expone.Finalmente, en el Capítulo VI se testeó la toxicidad aguda de NPs de Ag de 5 nm cubiertas de poli N-vinil-2-pirrolidona y polietilenimina (PVP-PEI) en larvas de artemia (Artemia sp) y en embriones de pez cebra y se evaluó la bioacumulación y los efectos de la transferencia de plata a través de la dieta. Se registró acumulación de plata en artemias expuestas a 100 y 1000 ¿g/L de NPs de Ag durante 24 h. Basándonos en estos resultados, se expusieron artemias a dos concentraciones diferentes de NPs de Ag, 100 ng/L como una concentración ambientalmente relevante y 100 ¿g/L como una concentración potencialmente efectiva. Estas artemias se utilizaron para alimentar a los peces cebra durante 21 días simulando una cadena trófica simple de dos niveles. Para las larvas de artemia, los valores de EC50 obtenidos oscilaron entre 7.39 mg Ag/L (larvas de 48 h expuestas durante 48 h) y 19.63 mg Ag/L (larvas de 24 h expuestas durante 24 h), mientras que para los embriones de pez cebra el valor de LC50 a las 120 h fue de 0.052 mg Ag/L. Mediante autometalografía se observó que los peces cebra alimentados con artemias expuestas a NPs de Ag acumularon mayor cantidad de metal en el intestino que en el hígado, aunque en ambos órganos se observó el mismo patrón de acumulación de metal dependiente de la dosis y del tiempo. Tres días de dieta con artemias expuestas a 100 ng/L de NPs de Ag fue suficiente para alterar la salud general de los peces, según se reflejó en la reducción significativa del tiempo necesario para desestabilizar la membrana lisosómica y por la presencia de diversas histopatologías en el hígado. En general, los resultados de este trabajo mostraron que la exposición a NPs de Ag a través de la dieta fue capaz de provocar efectos tóxicos en el pez cebra, incluso a concentraciones ambientalmente relevantes, lo cual indica la necesidad de llevar a cabo estudios más detallados sobre el impacto real de los nanomateriales en el medio ambiente.es_ES
dc.description.sponsorshipCell Biology in Environmental Toxicology Group
dc.language.isoenges_ES
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccesses_ES
dc.subjectzoologyes_ES
dc.subjectcell biologyes_ES
dc.subjectzoologíaes_ES
dc.subjectbiología celulares_ES
dc.titleEvaluation of the toxicity of metal and metal bearing nanoparticles in aquatic organisms using zebrafish as modeles_ES
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesises_ES
dc.rights.holder(c)2016 JOSE MARIA LACAVE LENA
dc.identifier.studentID638518es_ES
dc.identifier.projectID14326es_ES
dc.departamentoesZoología y biología celular animales_ES
dc.departamentoeuZoologia eta animalia zelulen biologiaes_ES


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