Computational and biophysical methods in characterization of protein-protein and protein-ligand interactions

Abstract

Todas las moléculas - tan simples como la molécula de hidrógeno o tan extremadamente complejas como una proteína - resultan de la unión de átomos individuales. Los átomos están unidos mediante fuerzas intramoleculares (enlaces iónicos, metálicos o covalentes, principalmente). Estas son las fuerzas que se deben vencer para que se produzca un cambio químico, es decir, la transformación de unas moléculas en otras. Los enlaeas covalentes son muy estables desde el punto de vista energético: se requiere mucha energía para romperlos. Sin embargo, existen tambien otras fuerzas intermoleculares, más débiles, que actúan sobre distintas moléculas o iones y que hacen que éstos se atraigan o se repelan. Estas son las fuerzas que determinan en gran medida las propiedades físicas de las sustancias biológicas. Son responsables de la estructura final de macromoléculas, de la unión específica entre moléculas, es decir, del reconocimiento molecular; de los procesos de autoorganización y ensamblaje de estructuras macromoleculares y celulares y de todo lo que suponga movimiento y comunicación a nivel celular y subcelular. Su importancia, por tanto, es fundamental para todos los aspectos estructurales y funcionales de los seres vivos. Por lo general son fuerzas de carácter débil pero, al ser muy numerosas, su contribución cooperativa es muy significativa y determinante.1,2Las proteínas son macromoléculas biológicas formadas por unidades denominadas aminoácidos y juegan un papel esencial en el funcionamiento de cualquier organismo. Adoptan una estructura espacial tridimensional organizada y ordenada, estrechamente relacionada con su función específica. La función desempeñada por cada proteína puede estar regulada mediante la interacción con otras proteínas y/o moléculas de bajo peso molecular (moléculas orgánicas pequeñas o metales) denominadas ligandos, cuya función puede ser de regulación (actuando como activadores e inhibidores), constitutiva (cofactores), u otra, de modo que dicha interacción regula la función de la proteína. La interacción con otras moléculas puede conllevar un cambio en la conformación tridimensional de una proteína y, por tanto, modula su función. El mal funcionamiento de una o varias proteínas derivado de cambios en la composición de aminoácidos (mutación) es la causa de numerosas enfermedades genéticas. Las mutaciones pueden provocar un plegamiento erróneo de la molécula o una alteración estructural que afecta a la función, desencadenando un proceso patológico. Entender el comportamiento de las proteínas y sus interacciones abre una puerta hacia el desarrollo racional de tratamientos adecuados: 1) introducciendo en el organismo una versión correcta de la proteína (terapia génica); 2) inactivando una proteína (inhibición), 3) rescatando la conformación estructural y la función correcta mediante fármacos.31 http://www.ehu.eus/biomoleculas/moleculas/fuerzas.htm2 http://bioquibi.webs.ull.es/temascompletos/InteraccionesNC/inicio.htm3 http://oldwww.bifi.es/research/protein_ligand_inter/protein_ligand_inter_es.phpIIExiste una gran variedad de métodos para descubir, analizar y caracterizar las interacciones intra- u intermoleculares dependiendo de los propósitos que nos motivan. La caracterización experimental de biomoléculas es posible con resolución atómica, mediante el uso de técnicas tales como la cristalografía de rayos X o la RMN, o a menor resolución, técnicas cinéticas (velocidad de reacción) o termodinámicas (equilibrio químico). Por otro lado, para el estudio teórico de interacciones intermoleculares y la caracterización y el análisis de la energética de unión se usan a menudo los métodos computacionales. De todos modos, los mejores resultados siempre se obtienen de la combinacion razonable de los dos métodos teoreticos y experimentales.Mis estudios doctorales en el proyecto ¿Métodos computacionales y biofísicos para la caracterización de interacciones proteína-proteína y proteína-ligando¿ se centran en la busca del equilibrio entre dichos métodos. Concretamente me he centrado en la investigación de las interaciones entre proteinas (en el ejemplo de las conexinas) y las interaciones entre una proteina y su ligando (en el ejemplo de las enzimas involucradas en la biosíntesis del grupo hemo).CONEXINASFigura 1. Canales de conexina. Canales de conexina. a) Todas las conexinas comparten la misma topología transmembranal, consistente en 4 dominios transmembrana (M1-M4) , un asa citoplasmática (CL), dos asas extracelulares (E1, E2) y el dominio del amino- y del carboxilo-terminal orientados hacia el interior celular. b) Los canales intercelulares se forman en dos etapas; primero se forman los precursores o hemicanales por la oligomerización de seis subunidades de conexina en cada una de las células, y luego el canal intercelular al unirse los dos hemicanales. Los hemicanales de algunas conexinas pueden también ser funcionales formando una vía de señalización entre el interior y el exterior celular.4Las conexinas forman canales intercelulares que, a diferencia de otros tipos de canales iónicos, atraviesan dos membranas plasmáticas y posibilitan la comunicación directa los citoplasmas de las células adyacentes (Figura 1). Por el poro de estos canales pueden difundir iones, metabolitos, segundos mensajeros y en general moléculas de hasta 1kDa. Este tipo de comunicación directa de célula a célula está presente en la gran mayoría de los tejidos y tipos celulares y participa en multitud procesos, entre los que se incluye el control de la proliferación y la diferenciación celular, la transmisión de señales eléctricas, la coordinación de la actividad metabólica y el mantenimiento de la homeostasis celular. La relevancia que actualmente se le reconoce a esta familia de proteínas deriva, en parte, del descubrimiento de varias patologías causadas por mutaciones en distintos genes de conexina. Entre estas enfermedades cabe destacar las que cursan con defectos de la4 Conectado por conexinas: ¿Comunicación intercellular mediada por canales de conexinas y enfermedades asociadas a mutaciones en los genes de conexina¿, Luis C. Barrio y Daniel González-Nieto, Unidad de Neurología Experimental, Hospital ¿Ramón y Cajal¿, Articulo divulgado en el Mayo 2012, non-indexed journalIIImielina, pérdida de la audición, alteraciones dermatológicas, cataratas y otros síndromes mas complejos que pueden afectar a varios tejidos u órganos. Comprender el amplio rango de los defectos genéticos y la diversidad de los efectos de las mutaciones es importante para los pacientes y el consejo genético, para entender la patogénesis de la enfermedad y, en última instancia, para el desarrollo de terapias especificas.4En colaboración con el grupo experimental de Dr. Luis Barrio y usando métodos computacionales hemos buscado las relaciones entre las mutaciones, la estructura y el funcionamiento. Debido al elevado peso molecular y la localizacion transmembranal de la biomolécula, los canals resultan casi imposibles de crystalizar; hasta ahora solo una structura ha sido depositada ¿ Cx26 con el PDB ID 2ZW35. Con esta structura como una base, hemos creado una serie de modelos para otras conexinas y canals (Cx32, Cx47). Para predecir y describir la energetica de unión y sus cambios causados por diferentes mutaciones hemos empleado algoritmos computacionales de "molecular docking", basados en diferentes campos de fuerza. De esta forma es posible validar diferentes modelos teóricos utilizando los datos obtenidos por la caracterización experimental.Los objetivos del presente proyecto son:¿ Caracterizar las interacciones proteína-proteína entre hemicanales creados por las proteinas de diferente masa molecular (Cx26, Cx32 y Cx47) usando ¿molecular docking¿ procedure (en comparación con los resultados experimentales).¿ Caracterizar el efecto de la mutación sobre el proceso de acoplamiento de los hemicanales.¿ Caracterizar la función de los diferentes motivos estructurales de las cadenas de conexina, utilizando ¿molecular docking¿ y simulaciones de dinámica molecular.Los resultados obtenidos son:¿ Usando ¿molecular modelling¿ hemos creado modelos structurales homólogos para las conexinas Cx26, Cx32 y Cx47. Hemos establecido un protocolo para generar todos los tipos de canales (homo-/heteromerico, homo-/heterotípico) que posteriormente han servido para la caracterizacion del proceso acoplamiento de los hemicanales.¿ Se encontró que la energía puede ser considerada como un descriptor de la fuerza de acoplamiento dado que refleja la complementariedad energética entre los dos hemicanales en el canal. La bondad del ajuste para este parámetro y los rendimientos experimentales para la formación GJ revelan que este es un factor clave para la formación de los canales, también explicando los aspectos importantes de la "promiscuidad" de las conexina. Por otra parte, tal acuerdo valida el novedoso método que se ha utilizado.¿ Mis estudios confirman la relevancia de los giros extracellulares en la formación de canales y el papel crucial del residuo Asn176 de Cx26 (y los correspondientes en otras isoformas de Cx) y residuos Asn54 de Cx26 para la estabilidad del canal. También revelan que la composición hemicanal sólo es parcialmente responsable de la formación de canal, mientras que la disposición relativa de conexinas en los hemichannels en última instancia definen la compatibilidad hemicanal.5 Song G, Li Y, Cheng C, Zhao Y, Gao A, Zhang R, Joachimiak A, Shaw N & Liu Z-J (2009) Structural insight into acute intermittent porphyria. FASEB J 23, 396¿404.IV¿ Compatible con los estudios funcionales, el análisis de las trayectorias de MD para la proteína hemicanálica Cx47 nativa y sus versiones alteradas demostró la importancia del dominio N-terminal y del primer dominio transmembrana para el buen funcionamiento de los hemicanales. Las simulaciones que se han llevado a cabo identifican, por primera vez para la proteína Cx47, los residuos cruciales para la organización del poro.ENZIMAS DE LA BIOSÍNTESIS DEL GRUPO HEMOFigura 2. Resumen de la biosíntesis del grupo hemo.6 La deaminasa porfobilinógeno (PBGD) y la uroporfirinógeno sintasa (UROIIIS) marcadas en verde. Paso patógeno marcado en rojo.El grupo hemo y sus derivados son imprescindibles para la vida y el proceso que lleva a su producción se encuentra altamente conservado en todos los seres vivos (Figura 2). El 85% del grupo hemo se sintetiza en células eritroides y se destina para la producción de hemoglobina, mientras que el 15% restante sirve como grupo prostético de enzimas dependientes del citocromo P450 y de otras hemoproteinas. La pérdida (parcial) de la actividad enzimática de alguno de las ocho enzimas involucrados conlleva la aparición de una patología denominada genéricamente porfíria. Dicha deficiencia funcional está asociada a una mutación en la secuencia de aminoácidos del enzima y la patología específica varía en función del enzima que contiene la mutación. Las porfírias están catalogadas como enfermedades raras, graves y generalmente incurables. Todos los6 Autor de la ilustracion desconocido.Vpacientes de porfíria adolecen de anemia hemolítica y fotosensibilización de la piel. Sin embargo, la sintomatología completa depende de la variante específica de porfíria.7,8Mi trabajo de tesis se centra en una de las líneas principales de investigación del grupo, el estudio de dos de las enzimas involucradas en la biosíntesis del grupo hemo - la porfobilinógeno deaminasa (PBGD) y la uroporfirinógeno sintasa (UROIIIS) causantes, respectivamente, de la porfiria aguda intermitente y la porfiria eritropoyética congénita - desde el punto de vista sintomatológico, la porfíria más severa. El objetivo es entender el mecanismo de la ruta enzimática para así poder modularla. Para esto hemos utilizado ensayos enzimáticos para medir la actividad de las enzimas in vitro e in vivo, cristalografía de rayos X para obtener información estructural de alta resolución sobre los distintos enzimas y métodos computacionales para el diseño y caracterización de inhibidores.Los objetivos concretos del proyecto son:¿ Diseño, optimización y validado de inhibidores de la PBGD.¿ Determinación y validado de los residuos claves para la catálisis de la PBGD.¿ Separación y caracterización de los complejos intermedios de la reacción catalizada por la PBGD.¿ Caracterización de la estabilidad de los mutantes más común de la UROIIIS que producen porfíria eritropoyética congénita utilizando métodos computacionales.Los resultados obtenidos son:¿ A partir del análisis de la interacción molecular, se ha identificado una lista de compuestos que exhiben potencial inhibición de la PBGD por analogía de sustrato. También se ha detectado y caracterizado un sitio de unión secundario, activo en la acción inhibitoria.¿ Los ensayos enzimáticos con el compuesto seleccionado indican inhibición competitiva y, por tanto, confirma la interacción observada in silico. Por otra parte, estos resultados indican que la PBGD se puede inhibir eficazmente por moléculas orgánicas pequeñas; compuestos ensayados constituyen una nueva línea de inhibidores de la cual 2,5-dimetil-1H-pirrol que demuestran el mayor nivel de inhibición en la relación a su concentración en la solución de reacción se ha establecido como una referencia para ensayos adicionales.¿ Las modificaciones del protocolo para la purificación de la PBGD han permitido la separación y el análisis de los intermediatos de la reaccion catalizada por el enzima, aptos para los estudios estructurales. Los resultados demuestran el carácter dinámico del enzima y representan ¿ por primera vez ¿ datos de difracción de los intermedios de la reacción.¿ Estudios de la UROIIIS permitieron comprender la delicada interacción entre Cys73 y la estabilidad cinética de la proteína y demostraron que las interacciones electrostáticas no covalentes en este sitio son capaces de restituirr parcialmente la estabilidad y la actividad de la enzima.7 Desnick, R. J.; Astrin, K. H. Congenital erythropoietic porphyria: advances in pathogenesis and treatment. Br J Haematol 2002, 117, 779-95.8 Warner, C. A.; Yoo, H. W.; Roberts, A. G.; Desnick, R. J. Congenital erythropoietic porphyria: identification and expression of exonic mutations in the uroporphyrinogen III synthase gene. J Clin Invest 1992, 89, 693-700