Desarrollo de activadores transcripcionales programables para plantas basados en el sistema CRISPR/Cas9

Abstract

[ES] La capacidad de reconocimiento específico y unión al ADN del sistema CRISPR/Cas9 ofrece posibilidades sin precedentes en el campo de la biología sintética de plantas. Las modificaciones de la proteína Cas9 o su guía de ARN permiten la expansión del rango de actividades de Cas9, desde su actividad de nucleasa original hasta otras actividades relacionadas con la unión al ADN, como la activación/represión transcripcional. Esto abre la posibilidad de crear circuitos de regulación que permitan controlar la expresión génica con mayor precisión. El objetivo de este trabajo consiste en el diseño y la evaluación de nuevos factores de transcripción programables basados en el sistema CRISPR/Cas9.

Para optimizar el sistema CRISPR/Cas9 como herramienta se empleó una versión catalíticamente inactiva de la endonucleasa Cas9 (dead Cas9 o dCas9) a la que se unieron mediante dos estrategias distintas una serie de dominios de activación transcripcional.

Una de las estrategias empleadas, denominada dCas9-SAM o “sinergia de mediadores de activación” consistió en la modificación del ARN guía mediante la incorporación de aptámeros que son reconocidos por la proteína de la cubierta del virus MS2 fusionada a dominios de activación. Como segunda aproximación, se utilizó la estrategia dCas9-Suntag que consiste en la adición de un péptido en el extremo C-terminal, que contiene varias repeticiones de un epítopo que es reconocido por un anticuerpo fusionado a un dominio activador.

El estudio de la activación transcripcional se ha llevado a cabo en Nicotiana benthamiana utilizando como diana de activación el promotor de la dihidroflavonol reductasa de Solanum lycopersicum, que es un promotor de actividad baja pero inducible por factores de transcripción endógenos tipo MYB. De las dos estrategias evaluadas en este estudio se obtuvieron mayores niveles de expresión con la estrategia dCas9-SAM, alcanzando tasas de activación de más de 20 veces sobre los valores de referencia del promotor no activado.

[EN} The specific DNA recognition and binding capacity of the CRISPR/Cas9 system offers unprecedented possibilities in the field of Plant Synthetic Biology. Modifications of Cas9 or its guide RNA allow the expansion of Cas9 activities, from the original nuclease function to other activities related to DNA binding, such as transcriptional activation or repression. This opens the possibility of creating regulatory circuits that allow controlling genetic expression with greater precision. The aim of this work consists on the design and evaluation of new programmable transcriptional activators based on the CRISPR/Cas9 system.

In order to optimise the CRISPR/Cas9 system as a tool for transcriptional regulation a catalytically inactive version of the Cas9 endonuclease (dead Cas9 or dCas9) was used, to which a series of transcriptional activation domains were bound by two different strategies.

One of the strategies, dCas9-SAM (Synergistic activation mediator) is based on the incorporation of aptamers to the gRNA scaffold, to which viral coat proteins fused to activator domains will bind. A second approach was dCas9-Suntag. This strategy consists on the addition of a C-terminal peptide, which contains several repeats of an epitope that is recognized by antibodies fused to transcriptional regulator domains.

The study of transcriptional activation has been carried out in Nicotiana benthamiana, targeting the dihydroflavonol reductase promoter of Solanum lycopersicum, which is a weak promoter, inducible by endogenous MYB-like transcriptional factors. As a result of this study it was found that the dCas9-SAM strategy results in higher levels of expression, reaching increases in transcription rates of more than 20 fold as compared with the reference values of the non-activated promoter.