UBE3Aren substratuak identifikatzen Angelman sindromearen ingurukoak argitzeko.

Abstract

Angelman syndrome (AS) is a rare neurodevelopmental disease that results from loss of function of the maternal UBE3A gene. UBE3A codes for an E3 ubiquitin ligase, that coordinately with E1 and E2 enzymes, attaches ubiquitin to proteins. Ubiquitination plays a key role in the fate of proteins. For instance, it can target a protein for degradation, relocate the protein within the cell or determine protein-protein interactions. Therefore, considering the relevance of ubiquitination, and the function of UBE3A, it could be anticipated that in the absence of UBE3A, the ubiquitination pattern of its substrates will be inadequate, thus affecting not only proteins, but also cell physiology. Consequently, to understand the aetiology of the neuronal defects in AS patients, it is mandatory to know which the substrates of UBE3A are. With that aim, we compared the proteins that are ubiquitinated in Drosophila flies overexpressing and not overexpressing UBE3A. Briefly, we combined the BioUb strategy developed in our lab with mass spectrometry, to isolate and detect ubiquitinated proteins, respectively. From the hundreds of proteins detected, 79 fulfilled the criteria to be considered as putative UBE3A substrate. One of those proteins was Rpn10, previously reported to be a UBE3A substrate. Additionally, we confirmed MS results indicating that Rngo might be a UBE3A substrate. Moreover, using human cells we proved that human Rngo homolog DDI1 is also a UBE3A substrate. Now we plan to (i) validate more UBE3A substrates, (ii) check whether those proteins are also substrates in human, and (iii) characterize their biological role.; Angelman sindromea neurogarapenezko gaixotasun bakana da, eta, arrazoiak arrazoi, neuronetan amarengandik jasotako UBE3A genearen kopia adierazten ez duten gizabanakoek pairatzen dute. UBE3Ak E3 ubikuitina ligasa entzima bat kodetzen du, zeina, E1 eta E2 entzimekin elkarlanean, itu-proteinei ubikuitina deritzon molekula txiki bat itsasteaz arduratzen den. Proteina bati ubikuitina gehitzeak berebiziko eragina izan dezake beraren patuan; izan ere, besteak beste, proteinen biziraupena, zelula barruko kokapena edota proteinen arteko elkarrekintzak baldintzatu ditzake. Beraz, ubikuitinazio-prozesuaren garrantzia ikusirik, eta UBE3Aren funtzioa zein den aintzat hartuta, pentsatzekoa da UBE3Aren faltan beraren itu-proteinen ubikuitinazio-maila gutxitua egongo dela, eta horrek eragin zuzena izango duela ez soilik proteinetan, baita zelularen funtzionamenduan ere. Angelman sindromea pairatzen dutenen zelula mailako kalteen jatorria ulertzeko, ezinbestekoa da UBE3Ak kodetzen duen E3 ubikuitina ligasaren itu-proteinak edo substratuak zeintzuk diren jakitea. Hori argitze aldera, UBE3A gainadierazten duten eta gainadierazten ez duten Drosophila eulietan ubikuitinatuta dauden proteinak aztertu eta konparatu ditugu. Ubikuitinatutako proteinak arrantzatzeko, gure laborategian garatutako BioUb estrategia erabili dugu, eta, ondoren, horiek identifikatzeko eta kuantifikatzeko, masa-espektrometria (MS) erabili dugu. Identifikatutako ehunka proteinetatik, 79k betetzen dituzte UBE3Aren substratu izateko irizpideak. Horien artean dago Rnp10, aurretiaz UBE3Aren itu-proteina gisa deskribatu den proteina. Horrez gain, Rngo deituriko proteinak piztu zuen gure arreta, eta, biologia molekularreko teknika osagarriak erabiliz, MS bidezko emaitzak berretsi ditugu. Gainera, giza zelulak erabiliz, Rngo-ren homologoa den DDI1 ere UBE3Aren substratua dela frogatu dugu. Etorkizunean, gure helburu nagusiak hiru dira: (i) MS bidez identifikatutako UBE3Aren substratu-izangai gehiago egiaztatzea, (ii) proteina horiek gizakietan ere UBE3Aren substratuak direnentz frogatzea, eta (iii) UBE3Aren substratuek zelula mailan betetzen dituzten funtzioak aztertzea.