Development of biotin-based strategies to dissect the ubiquitin code.

Abstract

La naturaleza dinámica y reversible de las modificaciones post-traduccionales por parte de los miembros de la familia de la ubiquitina plantea importantes desafíos durante su investigación. En esta Tesis presentamos dos nuevas estrategias, SUMO-ID y E3-ID, basadas en proteómica de proximidad y marcaje por biotina, que permiten investigar a fondo los fundamentos biológicos de los códigos de ubiquitina y SUMO. Por un lado, SUMO-ID combina la biotinilación de proximidad mediada por la enzima TurboID con la complementación de fragmentos proteicos para identificar interactores de proteínas de interés dependientes de SUMO. Hemos desarrollado un punto de escisión optimizado de TurboID y, fusionando un fragmento a SUMO y el fragmento complementario a PML, hemos podido identificar numerosos interactores de PML dependientes de SUMO. Hemos demostrado que dichos interactores representan un subconjunto del proteoma de los cuerpos nucleares de PML maduros y que participan en procesos nucleares esenciales tales como transcripción, reparación del ADN, respuesta al estrés y SUMOilación, estando altamente enriquecidos en motivos de interacción con SUMO. Asimismo, SUMO-ID nos ha permitido identificar nuevos interactores de SALL1 SUMOilado, cuyo rol es todavía desconocido. Finalmente, utilizando TP53 como sustrato, hemos identificado qué proteínas interactúan preferencialmente vía SUMO1, SUMO2 o ubiquitina, lo que demuestra la gran especificidad de SUMO-ID y que se puede aplicar para estudiar otras interacciones UbL-dependientes. Por otro lado, E3-ID se basa en la enzima BirA que biotinila específicamente la secuencia AviTag. Expresando en células la fusión de AviTag con ubiquitina junto a la fusión de BirA con una E3 ligasa de interés, E3-ID permite identificar sustratos específicos de E3 ligasas de ubiquitina. Mediante un AviTag de baja afinidad, el sistema E3-ID identifica específicamente los substratos de la E3 ligasa tipo RING RNF4, lo que ha permitido caracterizar sus funciones fundamentales en la respuesta al daño de DNA y en la regulación de los cuerpos nucleares de PML. También se han identificado substratos de la ubiquitina E3 ligasa MIB1, describiendo su participación en la endocitosis, la autofagia y la proteostasis centrosomal. Finalmente, aplicando E3-ID a las ligasas del tipo HECT NEDD4 y NEDD4L, e identificando nuevos substratos de NEDD4L se confirma su participación en la endocitosis de EGFR. En resumen, hemos desarrollado dos nuevas estrategias que contribuirán en gran medida a la investigación del código de las proteínas de la familia de ubiquitina y SUMO.