dc.description.abstract | [ES] Salmonella es uno de los patógenos alimentarios más importantes a nivel
mundial y causante de enfermedades gastroentéricas en humanos y animales. La
presencia de Salmonella en un alimento, sea en la cantidad que sea, se considera
peligroso y por lo tanto no será apto para el consumo humano. Por ello, los
controles microbiológicos rutinarios en la cadena alimentaria son de vital
importancia para no comprometer la salud del consumidor. Los controles se
deben realizar a lo largo de todo el proceso de elaboración del alimento, es decir,
controlando desde las condiciones implantadas en la granja hasta la calidad del
producto final que llegará al consumidor. Tradicionalmente los métodos
microbiológicos empleados para detectar patógenos en los alimentos han sido
métodos basados en el cultivo. El método tradicional de detección de Salmonella
comprende cuatro fases: una primera fase de preenriquecimiento no selectivo,
una segunda fase de enriquecimiento selectivo, un paso adicional de aislamiento
en medios sólidos selectivos, y una última fase de confirmación mediante pruebas
bioquímicas y serológicas. Estos procesos tradicionales de cultivo son laboriosos y
alargan la obtención de los resultados hasta una semana.
Las técnicas moleculares han sido un gran avance de las cuales la
microbiología se ha beneficiado para desarrollar métodos nuevos de detección de
patógenos. Entre ellas, las técnicas basadas en la amplificación de los ácidos
nucleicos como la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) proporcionan una
estrategia rápida y sensible para la detección de patógenos. Además, la mejora
que ha supuesto la PCR a tiempo real permite obtener los resultados incluso en
menos tiempo y evitar el procesado post-PCR que puede provocar contaminación
cruzada debido a la manipulación de las muestras.
En todo caso, para el desarrollo de métodos basados en PCR es esencial la
elección de una diana genética adecuada a cada patógeno que permita diseñar
técnicas totalmente específicas de la bacteria que se quiera detectar en cada
caso.
El objetivo principal de este trabajo fue crear métodos de detección de
Salmonella basados en la PCR que facilitasen y disminuyesen el tiempo requerido
para la obtención de los resultados. Para ello se cumplieron las siguientes etapas:
i) elección de una diana genética específica de Salmonella, ii) desarrollo de una
PCR para el diagnóstico de Salmonella, iii) desarrollo de sistemas de PCR a tiempo
real para detección de Salmonella, iv) validación de los métodos de PCR a tiempo
real diseñados frente al método tradicional de detección de Salmonella en
muestras de alimentos.
En primer lugar se estudiaron diferentes genes propuestos por diversos
autores como dianas genéticas de Salmonella. Tras realizar diversas reacciones de
PCR con las parejas de iniciadores correspondientes, se estableció que el gen más adecuado para utilizar como diana genética de Salmonella en métodos de PCR era
el gen invA. La proteína codificada por este gen pertenece a un sistema de
secreción totalmente necesario para causar la invasión bacteriana de las células
epiteliales del intestino. Al ser un gen involucrado con la virulencia de Salmonella,
presuntivamente estará en todos los aislamientos de Salmonella, o por lo menos,
en todas las cepas virulentas.
Una vez elegido el gen invA como diana genética específica de Salmonella
se diseñó una PCR, utilizando los mismos iniciadores descritos anteriormente por
Rahn K y colaboradores (1992), a la cual se añadió un control interno de
amplificación diseñado específicamente en este trabajo. La incorporación de
controles internos de amplificación a los métodos de PCR es esencial para
detectar posibles inhibiciones en las reacciones de PCR, causadas principalmente
por componentes presentes en los alimentos. Las 40 cepas de Salmonella
analizadas mediante esta PCR mostraron un resultado positivo para la
amplificación del gen invA, mientras que todos los aislamientos analizados de
microorganismos relacionados con esa bacteria fueron negativos.
Con la intención de disminuir aun más los tiempos de obtención de
resultados, se decidió adaptar esa PCR a un formato de PCR a tiempo real. Existen
diferentes sistemas de detección utilizados en PCR a tiempo real. En este trabajo
se eligió diseñar por un lado una PCR utilizando sondas TaqMan® como sistema
detección, y por otro lado una PCR a tiempo real utilizando SYBR Green I. En la
PCR a tiempo real con SYBR Green I los iniciadores utilizados fueron los mismos
que para la PCR convencional, pero se diseñó un nuevo control interno adecuado
para la PCR a tiempo real. Sin embargo, para la PCR a tiempo real con sonda se
diseñaron unos nuevos iniciadores y una sonda que hibridase específicamente con
el fragmento amplificado por esos iniciadores, además de un nuevo control
interno que fuese detectado mediante otra sonda adicional marcada con un
fluoróforo diferente. La especificidad de ambas reacciones de PCR a tiempo real
fue probada tanto de forma teórica mediante programas informáticos como de
manera experimental. La tecnología con sondas TaqMan® resultó ser más sensible
que la tecnología SYBR Green I en este estudio, aunque por otro lado, la ausencia
de reacción de la sonda con una de las cepas de Salmonella analizadas indicó que
esa tecnología era a su vez menos específica que el SYBR Green I.
Los métodos de PCR a tiempo real fueron comparados frente al método
tradicional de detección de Salmonella en diferentes muestras de alimentos. Para
realizar esta validación se siguió lo descrito en la norma ISO 16140:2003. Se
calcularon tanto la inclusividad y exclusividad de los métodos, así como la eficacia
relativa, especificidad relativa y sensibilidad relativa de los métodos moleculares, y también el nivel de detección relativa de éstos. En la PCR a tiempo real con sonda TaqMan® se utilizaron dos master mix comerciales diferentes (una master
mix de Takara y otra de Applied Biosystems) con el fin de analizar también la
influencia que ejerce la master mix empleada en los resultados. Para el cálculo de
la inclusividad se utilizaron 50 aislamientos diferentes de Salmonella según lo indicado en la citada norma ISO, obteniendo para todos ellos un resultado
positivo para la detección del gen invA. Para el test de exclusividad se analizaron
30 cepas de microorganismos relacionados con Salmonella, los cuales mostraron
un resultado negativo en las reacciones de amplificación. Para el cálculo de la
eficacia, especificidad y sensibilidad relativas se utilizaron 309 muestras de
alimentos diferentes según las categorías alimentarias descrita en la norma ISO.
Para obtener una amplia variedad de resultados positivos y negativos,
aproximadamente la mitad de esas 309 muestras de alimentos fueron
contaminadas artificialmente con Salmonella. Se obtuvieron unos valores
comprendidos entre 80%-100%, excepto en la sensibilidad relativa de la PCR a
tiempo real con sonda utilizando la master mix de Applied Biosystems que fue del
62,4%. Los niveles de detección relativa se calcularon según lo descrito en la
norma ISO para cinco alimentos diferentes (uno de cada categoría alimentaria),
utilizando para cada alimento 5 o 6 niveles de contaminación. Los resultados
obtenidos abarcaron un rango de 0,1-10 células/25gr de alimento. Excepto en la
PCR a tiempo real con sonda en la cual el límite de detección en muestras de
pescado fue de alrededor de 100 células/25gr.
A lo largo de todo el análisis realizado en alimentos se identificaron
diferentes etapas que se consideraron críticas a la hora de emplear métodos
moleculares para la detección de patógenos en alimentos. Uno de los principales
problemas surgidos fue la influencia que ejercía la composición del alimento a lo
largo de todo el proceso. Los mayores problemas se detectaron en los alimentos
con un alto contenido en grasa, dado que la grasa influye notablemente en la
capacidad de detección de los métodos moleculares. Otro de los puntos críticos
fue el método de extracción de ADN, que puede influir en la concentración del
ADN recuperado y en su calidad. Por todo ello, y al no existir un protocolo
universal de procesamiento de las muestras previo a las reacciones de PCR, se
debe optimizar cada método de análisis teniendo en cuenta el alimento que se
debe analizar y el patógeno que se quiere detectar, y amoldarlo a las
circunstancias especiales de cada laboratorio. | es |
dc.description.sponsorship | La presente Tesis Doctoral ha sido realizada gracias a la financiación recibida de
los siguientes Proyectos de Investigación: 1.Microbiología molecular: desarrollo de metodologías diagnósticas para bacterias y hongos basadas en el uso de herramienta
s bioinformáticas y técnicas moleculares. Grupos de Investigación Consolidados del SistemaUniversitario Vasco financiado por el Gobierno Vasco: IT-343-10 (2010-2012). 2.Nuevas aproximaciones a la detección de patógenos mediante el uso de la
genómica microbiana, la microbiología molecular y la inmunología.
Convocatoria Saiotek 2009. Proyectos de Incubación Científico-Tecnológicos. UPV/EHU: S-PC09UN04 (2009-2011). 3.Subvención General a Grupo de Investigación de la UPV/EHU: GIU05/42(2006-2008) y GIU08/20 (2009-2011). 4. Detección de Salmonella en alimentos de forma rápida y específica mediante técnicas genéticas. Acciones Destinadas a la Investigación, el Desarrollo y la Innovación Tecnológica de productos industriales en Álava. UPV/EHU-Dpto. de Educación, Universidades e Investigación de Gobierno
Vasco: PFA07/07 (2008). 5. Contratos de I+D en Empresas: Contratos de I+D con Laboratorios Bromatológicos Araba S.A. para la realización de un método de detección
de Salmonella en alimentos. (2002-2007).--- Becas: 1. Ayuda para la Formación de Personal Investigador en la Universidad de
País Vasco. (Junio 2007-Mayo 2011. 2. Ayudas para fomentar la realización de tesis en eus
kara en la Universidad del País Vasco. (Octubre 2006-Mayo 2007). | es |