Proteómica dirigida en la cirugía del cáncer gástrico

Abstract

La estrategia de tratamiento quirúrgico para el cáncer gástrico se realiza en la actualidaden base a criterios de selección de pacientes según la estadificación de la clasificación TNMy/o la clasificación de Lauren y han sido clásicamente el ¿global gold standard¿ en la tomade decisiones clínicas.Las tres principales sociedades oncológicas europeas, ESMO (Sociedad Europea deOncología Médica), ESSO (Sociedad Europea de Oncología Quirúrgica) y ESTRO (SociedadEuropea de Radioterapia y Oncología), han publicado las directrices conjuntas para elmanejo del cáncer gástrico, analizando las evidencias actuales en los niveles derecomendación tanto para el diagnóstico como para el tratamiento.Sin embargo, los cambios más significativos en los cuidados de salud, se han producidocon el desarrollo de una medicina personalizada y de precisión, que redefine eldiagnóstico, estratifica a los pacientes, dirige la selección de la terapia óptima, informa dela sensibilidad individual a la quimio-radioterapia y establece el pronóstico.Brunnicardi ya propone en 2011 como estrategia básica en la práctica de una medicina ycirugía personalizadas un modelo basado en el perfil molecular del paciente, tanto para lasguías de elección terapéutica, como para la mejora en el seguimiento de los pacientesquirúrgicos.Genómica, proteómica y metabolómica, conforman un conjunto de estudios OMICs, quehan modificado la forma de diagnosticar y clasificar el cáncer gástrico.En la clasificación molecular basada en los patrones de expresión génica, se hanidentificado tres subtipos de adenocarcinoma gástrico, denominados mesenquimal,proliferativo, y metabólico.Por otro lado, con el fin de mejorar la clasificación del cáncer gástrico, identificar las clavesde sus vías de señalización, dianas terapéuticas y biomarcadores, la ¿Cancer Genome AtlasResearch Network¿, ha dividido el cáncer gástrico en cuatro subtipos molecularesdistintos.El primer subtipo lo configuran los pacientes infectados por ¿Ebstein Barr +¿ (asociados amutaciones del gen PIK3CA (fosfo inositol 3 kinasa)), un segundo subtipo presenta alta¿inestabilidad de microsatélites (MSI)¿, un tercer subtipo ¿genómicamente estable¿(relacionados con el subtipo difuso y con mutaciones del gen ¿RHOA¿), y, un cuartosubtipo ¿cromosómicamente inestable¿ (relacionado subtipo intestinal y conamplificaciones de los genes que codifican proteínas para los receptores tirosin-kinasa).En este sentido, datos clínicos de gran cantidad de pacientes obtenidos de la historiaclínica electrónica, son integrados con los datos de sus procesos biológicos realizados através de los análisis OMICs.Estudios observacionales durante el curso normal de los cuidados clínicos en relación conel diagnóstico y tratamiento han sido integrados para formar redes de conocimiento conlos datos obtenidos de la investigación OMICs.Resumen¿Proteómica dirigida en la cirugía del cáncer gástrico¿ 4Desde hace varios años, se vienen realizando enfoques de proteómica del descubrimiento,para analizar los perfiles de proteínas de muestras quirúrgicas con adenocarcinomagástrico primario y mucosa gástrica no tumoral, con el objetivo de identificar las proteínasespecíficas asociadas a la enfermedad, como potenciales biomarcadores clínicos, dianasterapéuticas y sus mecanismos moleculares.En los últimos años, se ha desarrollado una proteómica dirigida cuantitativa, que permiteseleccionar determinadas proteínas y sus péptidos correspondientes que ayudan aconocer la participación de éstas en la carcinogénesis o como dianas terapéuticas.Con estos antecedentes planteamos como hipótesis de trabajo para el desarrollo delproyecto en el que se fundamenta esta tesis doctoral que, si realizábamos un análisisclínico exhaustivo de los pacientes que habitualmente diagnosticamos y tratamos decáncer gástrico y lo integrábamos con los datos obtenidos de la cuantificación proteica porproteómica dirigida, podríamos mejorar nuestras decisiones terapéuticas para estaenfermedad.Con este fin se seleccionaron prospectivamente diecinueve pacientes intervenidos poradenocarcinoma gástrico, que cumplieran criterios de inclusión para este estudio,realizándose un análisis exhaustivo de toda su información clínica.El material utilizado procedente de las intervenciones quirúrgicas realizadas (tejidogástrico sano y tumoral de cada paciente), fueron vehiculizados a través del BiobancoVasco para su conservación a -80ºC en OCT (Optimal Cutting Culture) hasta su utilización.El flujo de trabajo fue completado, con la retirada del OCT, homogeneización, digestióntríptica, adición de péptidos pesados y análisis de proteómica dirigida y cuantificación deproteínas por la plataforma proteómica, y simultáneamente fue elaborada una base dedatos para la recogida de los datos clínicos de los pacientes.Como primer paso de puesta a punto de la metodología proteómica dirigida, con el fin deestandarizar los métodos de digestión y homogenización en la preparación de muestrascomplejas y heterogéneas se comenzaron las pruebas con tejido de murinos en Marzo2013.Concluyéndose de esta fase que la homogeneización con el sistema Precellys, así como ladigestión de las proteínas mediante el método FASP, sirven de manera óptima para suutilización con muestras tisulares de ratón y que el número de proteínas identificadas porproteómica del descubrimiento obtenida por cromatografía líquida y espectrometría demasas, es similar al número de proteínas que se obtienen con los flujos de trabajohabituales.A finales de Abril 2013, tras la puesta a punto de la metodología y los resultadosobtenidos en el procesamiento del tejido gástrico en murinos se decidió trasladar elResumen¿Proteómica dirigida en la cirugía del cáncer gástrico¿ 5análisis del ratón al humano, para lo que se seleccionó uno de los diecinueve pacientes queconforman parte de este estudio.La finalidad de esta fase del estudio fue obtener información experimental de un panelextenso de proteínas y péptidos de tejido gástrico humano por proteómica deldescubrimiento para seleccionar las más adecuadas y realizar el estudio de proteómicadirigida posterior.En cuanto a la metolodología de esta fase, en lo referente al tratamiento de las muestrasincluidas en OCT para su conservación en los biobancos correspondientes, se concluye queno hay diferencias significativas en el número proteínas obtenidas con los procedimientosde limpieza utilizados, tanto con PBS o con carnoy y que la funcionalidad de estasproteínas en los tejidos analizados, permanece intacta.Los criterios de selección de proteínas y péptidos para hacer el análisis de proteómicadirigida fueron, en primer lugar, proteínas con probada participación en el proceso decarcinogénesis gástrica y/o dianas terapéuticas y, en segundo lugar, péptidos queidentifiquen específicamente a las proteínas seleccionadas y que hayan sido detectadospor espectrometría de masas en el Servicio de Proteómica.En base a los criterios mencionados se han seleccionado las siguientes proteínas ypéptidos:Péptido Proteína CódigouniprotDescripciónIPLENLQIIRG EGFR_HUMAN P00533 Epidermal growth factorreceptorSPSDCCHNQCAAGCTGPR EGFR_HUMAN P00533 Epidermal growth factorreceptorVADPDHDHTGFLTEYVATR MK01_HUMAN P28482 Mitogen-activatedprotein kinase 1RTEGVGPGVPGEVEMVK MK03_HUMAN P27361 Mitogen-activatedprotein kinase 3EEWTTAIQTVADGLK AKT1_HUMAN P31749 RAC-alphaserine/threonine-proteinkinaseGWEEGVAQMSVGQR FKB1A_HUMAN P62942 Peptidyl-prolyl cis-transisomerase FKBP1ALas proteínas seleccionadas EGFR, MK01, MK03 pertenecen a la vía de señalización RASRAF-MEK-ERK1/2 con receptores tirosin kinasa (RTKs).La proteína AKT1 pertenece a la vía de señalización PI3K/AKT (fosfo inositol 3-kinasa, conreceptores serine/treonine-protein kinase).Resumen¿Proteómica dirigida en la cirugía del cáncer gástrico¿ 6Y, por último, la proteína seleccionada FKB1A pertenece a la vía de señalización del TGF¿(factor transformante del crecimiento), con receptores serina/threonina kinasa.En una primera fase del desarrollo de la metodología de la proteómica dirigida puesta enmarcha, se plantea la posibilidad de la utilización de un péptido común, como el péptido dela levadura ENO1_YEAST, para normalizar la cuantificación peptídica en el tejido humanocon cáncer gástrico.Éste no ha sido un procedimiento fiable para obtener resultados homogéneos decuantificación y con tiempos de elución similares, por lo que se decidió, en una segundafase, utilizar para la normalización del procedimiento un péptido pesado.La presencia de un péptido marcado ayuda a determinar la presencia del péptido natural ypermite normalizar la intensidad del péptido natural frente al péptido pesado y, enprincipio, obtener una cuantificación más fiable.De las proteínas y péptidos descritos previamente, hemos analizado los cocientes decuantificación (relación tejido sano-tejido tumoral) agrupándolos por estadíos tumorales.En el análisis de datos de los resultados de los cocientes de cuantificación de los péptidosde las proteinas estudiadas, hemos analizado en primer lugar, las relaciones entre losvalores de sus cocientes de cuantificación (Ccs), mediante métodos de regresión lineal ymúltiple.En segundo lugar, hemos analizado la variabilidad de esta muestra agrupada por estadíosmediante el método de las funciones empíricas ortogonales.Y, en tercer lugar, con los datos obtenidos hemos realizado una simulación de curvas delos valores de los Ccs para cada proteína, para cada uno de los estadíos tumorales,mediante el método de las autofunciones.Los resultados de los análisis de regresión lineal y regresión múltiple obtenidos para lasternas (MK01, EGFR1-MK03) y (FKBP1A, EGFR1-AKT), confirman la relación lineal entrelos valores de los cocientes de cuantificación de las proteínas analizadas y que, conocidoslos valores de dos de ellos, se puede obtener el cociente de cuantificación del tercero, conun error máximo acotado.El siguiente paso, ha consistido en unir los datos experimentales proteómicos con losdatos clínicos relativos a los estadíos tumorales de cada paciente.Se han agrupado los valores de cuantificación de las proteínas por estadíos tumorales,calculado el valor medio de los datos disponibles para cada proteína y analizado ladependencia funcional de estos valores medios con el estadío tumoral.Como resultado de lo anteriormente expuesto, se pueden identificar cuatro regiones decomportamiento del cociente de cuantificación de cada uno de los péptidos: decaimiento,valor mínimo, crecimiento y dominio tumoral.Resumen¿Proteómica dirigida en la cirugía del cáncer gástrico¿ 7La región de decaimiento se corresponde con los estadíos I-A/II-A, la región de valoresmínimos, con los estadíos II-A/II-B, la región de crecimiento con los estadíos II-C/III-C y,por último, la región de "dominio tumoral" con los estadíos III-C/IV.Este patrón de comportamiento de los valores medios de los Ccs, puede ser de aplicaciónen la práctica clínica. A medida que evoluciona en el tiempo el cáncer gástrico, podemospredecir, según el estadío tumoral en el que se encuentra la enfermedad, el Cc de cadaproteína, para cada paciente y viceversa.Así mismo, a partir de los valores de cuantificación obtenidos se han confeccionado unascurvas de simulación predictiva para cada proteína en cada uno de los estadíos tumoralesdel paciente, lo que tendría una potencial aplicabilidad práctica.Por un lado, conocido el estadío tumoral clínico del paciente previo a iniciar eltratamiento, podemos conocer los valores simulados de los Ccs de las cinco proteínasestudiadas en esta tesis (utilizando las tablas y calculando el valor, o simplemente,entrando en la gráfica de cada proteína y midiendo su valor).Así, si compararamos el resultado de estadiaje de nuestra simulación y el obtenido tras elanálisis proteómico del paciente a estudio, en el caso de que ambos resultados fueran¿aproximadamente¿ coincidentes, las curvas simuladas se podrían utilizar en elseguimiento del paciente, tomando a aquellos como valores de referencia.Y, por otro lado, estas curvas también se podrían utilizar para verificar la respuesta de unpaciente a los fármacos administrados, ya que con las autofunciones se dispone de larespuesta (evolutiva) estándar del paciente con cáncer gástrico; de tal manera que, cuandolos resultados del seguimiento del paciente se desviaran claramente de estas curvas,entonces, se dispondría de una información bien referenciada e identificada paradeterminar el efecto de un determinado tratamiento.Por último, se han desarrollado en esta tesis, tres escenarios distintos para la utilizaciónpotencial de los datos obtenidos en el análisis estadístico.Como primer escenario tendríamos la caracterización del proteoma de una neoplasiagástrica multifocal en una paciente con inmunodeficiencia común variable (ICDV).La IDCV, que cursa entre otros cuadros con hipogammaglobulinemia, había aparecido en latercera década de vida, desarrollando su carcinoma gástrico dos décadas después. En suhistoria clínica, están reflejados factores de riesgo, que han actuado sobre la mucosagástrica normal, hasta llegar al desarrollo del carcinoma gástrico multifocal.La peculiaridad de este caso concreto, y por lo que se decidió su análisis en solitario, esque se trata de una paciente con un alteración de la inmunidad que presenta tres tumoresde distintas características histopatológicas. Por tanto, hemos tenido ante nosotros, unaoportunidad única, de analizar el comportamiento a nivel proteómico de tres tumoresdiferentes expuestos a un entorno idéntico.Resumen¿Proteómica dirigida en la cirugía del cáncer gástrico¿ 8Para su análisis, se han aplicado técnicas de clustering (que consisten en agrupar aquellasproteínas cuyos valores de los cocientes de cuantificación se comportan de manera similara lo largo de los diferentes estadíos) y se ha estudiado, también, la variabilidad de estamuestra agrupada por estadíos mediante el método de las funciones empíricasortogonales anteriormente descritas.Cabría destacar, cómo siendo dos de los tres tumores, carcinomas intramucosos en elmismo estadío IA, sus (Ccs) son totalmente diferentes, estando ésto en relación,probablemente, con los subtipos celulares que los componen (carcinoma intramucosopapilo-vellositario versus carcinoma intramucoso de células en anillo de sello). Sinembargo, el resultado de nuestro análisis, valores del EGFR1 menores de 1 a través delanálisis de regresión múltiple, sitúan, el comportamiento desde el punto de vistaproteómico, al carcinoma intramucoso de células en anillo de sello más próximo al tercerode ellos, carcinoma intestinal invasivo.De lo anteriormente expuesto, y desde el punto de vista meramente quirúrgico,tratándolos como casos independientes por su pronóstico esperable, se podría plantearque el abordaje de cada caso diferiría de los otros. Así, en el carcinoma intramucosopapilo-vellositario se podría plantear la resección local, en el carcinoma intramucoso decélulas en anillo de sello deberíamos ofertarle una gastrectomía con linfadenectomía D1,según sus criterios de riesgo, y, en el caso del adenocarcinoma intestinal infiltrante, lagastrectomía con linfadenectomía D2 debería ser el procedimiento de elección.Además, en cuanto al análisis de los Ccs del AKT1, el carcinoma intramucoso papilovellositariopresenta valores mayores a la unidad. Ésto podría reflejar una hiperactivaciónconstitutiva del AKT1, para activar y diferenciar a los linfocitos, mientras que en los otrosdos casos los valores están amortiguados, con inhibición progresiva de los valores delAKT1, indicándonos la progresión tumoral y empeoramiento del pronóstico, con un gradode agotamiento de la producción constitutiva del AKT1, en el tejido sano y tumoral.En un segundo escenario, hemos estudiado la caracterización del proteoma deladenocarcinoma gástrico con diferente fenotipo celular y estadío tumoral.El análisis de los datos lo hemos realizado agrupando a los pacientes que se encontrabanen estadíos tumorales III y IV.La alta expresión del EGFR1 se correlaciona positivamente con la localización y tamañotumoral, grado de diferenciación celular, profundidad de invasión, metástasis linfáticas,estadío TNM. Tumores mayores de 5 cm, localizados en la parte distal, pobrementediferenciados, con invasión hasta la serosa y con metástasis linfáticas, en estadío III¿IV,tienen una mayor expresión del EGFR1.Los cocientes de cuantificación experimentales obtenidos a partir de las autofunciones,añaden un nuevo elemento de contraste con el que podemos simular datos y pueden seruna información adicional del paciente que ayude a la verificación, el seguimiento y elpronóstico de la evolución más probable de la enfermedad.Resumen¿Proteómica dirigida en la cirugía del cáncer gástrico¿ 9La integración de los datos relacionados con el tipo histopatológico, el estadío tumoral y lasupervivencia en meses del cáncer gástrico, además de los cocientes de cuantificación delas proteínas seleccionadas (determinados por cromatografía líquida y espectrometría demasas), son componentes de datos relevantes para, mejorar la identificación del estadíotumoral de estos pacientes, seleccionar mejor el tipo de cirugía y terapia médica a utilizary, previsiblemente, mejorar la significación estadística de las tasas de supervivencia global.Para concluir, como tercer escenario, se analizan los datos clínicos, anatomía patológica,valores de los Ccs y el comportamiento de estos datos en pacientes tratados sólo concirugía o con neoadyuvancia previa a la cirugía y su relación con la clasificación molecular.En nuestro estudio se han podido identificar cuatro regiones de comportamiento del valorde los Ccs de cada uno de las proteínas: decaimiento, valor mínimo, crecimiento y dominiotumoral (descrito previamente).No existe todavía ningún régimen de tratamiento universalmente aceptado para el cáncergástrico y diferentes países y centros ofrecen opciones de tratamiento distintas.Trabajos previos han demostrado que los subtipos de líneas celulares de cáncer gástricocon distintos patrones de expresión génica, están asociados al pronóstico y la respuesta ala quimioterapia de los pacientes. Las de tipo intestinal, fueron significativamente mássensibles a 5-FU y oxaliplatino, pero más resistentes a cisplatino, que las líneas decelulares con tipo difuso.En relación con el TNM, no se ha observado una ventaja en la supervivencia global de lospacientes tratados con quimioterapia preoperatoria. (p=0,36), ni en la supervivencia librede enfermedad (p=0,20), ni modifica la tasa de resección R0 (p=0,36).Tampoco se han encontrado diferencias significativas, ni en la supervivencia, ni en larecurrencia tumoral en relación con el subtipo molecular. La inestabilidad demicrosatélites tiene una mayor tendencia a la recurrencia que el resto de los subgrupos,aunque no es significativa.En nuestro estudio se han utilizado dos esquemas diferentes de tratamiento, por un lado,los pacientes 2, 3, 4, 5 y 10 fueron tratados con una pauta de tratamiento de quimioterapiaadyuvante postoperatoria ( 5-Fluorouroacilo y Leucovorin x 6 ciclos) y el paciente 11 con5-Fluorouroacilo y folinato cálcico.Asociado con la quimioterapia, los pacientes 2, 3, 4, 5 y 10 recibieron radioterapia a unadosis total máxima de 45 Gy según el ensayo SWOG/ Intergroup-0116.Y, por otro lado, los pacientes nº 12, 13, 14 y 15, fueron tratados con EOX x 3 ciclos (Epirrubucina, Oxaliplatino, Capecitabina), en forma de quimioterapia preoperatoria,completando la adyuvancia con el mismo esquema todos ellos, menos el nº 12 pormorbilidad asociada. Esquema de tratamiento sugerido por el ensayo holandés CRITICS(NCT00407186).Resumen¿Proteómica dirigida en la cirugía del cáncer gástrico¿ 10En este trabajo hemos realizado una comparativa de los resultados obtenidos a nivel delestudio proteómico en los pacientes que han sido tratados con quimioterapiapreopetaroria y los que no, correlacionándolo con sus estadíos tumorales.Hay discrepancia al correlacionar el estadío tumoral y los Ccs de las proteínas analizadasen los enfermos tratados con quimioterapia, cuando se utilizan como referencia las curvasde los valores de los Ccs de pacientes sin tratar con quimioterapia y se observa laevolución y supervivencia de estos pacientes.Los Ccs de la proteína EGFR1 crecen a partir de los estadíos IIA y IIB, tanto para lospacientes tratados, como sin tratar, pero lo hacen más rápidamente en los tratados conquimioterapia , al menos hasta el estadío III C.Los valores de los Ccs de la proteína MK03 tratados con quimioterapia y reclasificados enestadíos IIA, IIB, son mayores que los correspondientes a los valores de los pacientes sintratar con quimioterapia.Además, su tasa de crecimiento en relación al estadío tumoral, es muy baja, a diferencia delos pacientes que no fueron tratados con quimioterapia, que tienen un crecimiento muyalto del Ccs a partir del estadío III.Los valores de los Ccs de la proteína FKBP1A, tratados con quimioterapia y reclasificadosen estadíos II (IIB) , son mayores que los correspondientes a los valores de los pacientessin tratar con quimioterapia, siguiendo el mismo patrón que los Ccs de la proteína MK03.De forma análoga su tasa de crecimiento es muy baja, al menos hasta el estadío IIIB.La determinación de los cocientes de cuantificación de las proteínas analizadas en esteestudio, junto con la determinación del estadío tumoral en pacientes tratados conquimioterapia preoperatoria, permite diagnosticar con menor incertidumbre su estadíotumoral y en consecuencia ayuda a decidir con más información y precisión el tipo decirugía a realizar.No hay globalmente aceptado un estándar de tratamiento para el cáncer gástricoresecable. En lo que se refiere a la linfadenectomía D2, poe ejemplo, la clasificación porestadío tumoral preoperatoria, no es capaz de definir el tipo de linfadenectomía a realizar.De hecho, en nuestro trabajo, de los pacientes sometidos a neoadyuvancia se les realizauna linfadenectomía D2 a los pacientes 13 y 15.La cuantificación por metodología proteómica de las proteínas implicadas en las vías deseñalización de la carcinogénesis del cáncer gástrico, podría contribuir a seleccionar mejorlas pautas de tratamiento de nuestros pacientes y ayudar a establecer mejor su estadíotumoral y definir su pronóstico.Resumen¿Proteómica dirigida en la cirugía del cáncer gástrico¿ 11A efectos prácticos, se podría plantear una linfadenectomía D2, en aquellos tumores de laclasificación molecular de Bass, de tipo cromosómicamente inestables, que tengan unalocalización antral y con previsibles amplificaciones de los genes, que codifican proteínaspara la activación de los receptores tirosin kinasa, responsables de una proliferacióncelular aberrante.Desde nuestro punto de vista, la metodología proteómica dirigida junto con el estadíotumoral, ayudaría en una más correcta selección de un tratamiento personalizado paranuestros pacientes.