Structure-function relationships of tumor suppresor ING5

Abstract

La familia ING (INhibitor of Growth) de supresores tumorales está formada por cinco proteínas homólogas que regulan el estado transcripcional de la cromatina por medio del reclutamiento de complejos remodeladores de cromatina a los lugares con la marca trimetilada en la histona H3 (H3K4me3). Esta modificación es reconocida por el dominio C-terminal conservado, Plant HomeoDomain (PHD). La unión a péptidos de histona trimetilados por ING5 ha sido caracterizada por RMN para la proteína completa mostrando una afinidad del mismo rango micromolar que la calculada para el dominio PHD aislado. El miembro de la familia ING4 dimeriza a través de su dominio N-terminal y se pliega de forma simétrica con estructura helicoidal de forma que es un lector bivalente de la marca H3K4me3. Los miembros ING4 e ING5 presentan una alta homología en secuencia para su dominio N-terminal y comparten regiones conservadas, motivos de secuencia y dominios estructurales. En esta tesis doctoral, mostramos que ING5 también es un dímero, tanto en solución como en células, y que, por lo tanto, también es un lector bivalente de la marca H3K4me3. Sin embargo, la estructura cristalográfica del dominio N-terminal de ING5 muestra una interfaz de dimerización distinta de la descrita para ING4, mostrando un dímero asimétrico. Resultados obtenidos mediante técnicas en solución, como RMN (efecto en la relajación paramagnética y asignación de la cadena principal) y SAXS, demuestran que la estructura cristalográfica de ING5 es, probablemente, un artefacto de la cristalización. En esta tesis doctoral se ha estudiado, por primera vez, la función específica de su región NLS de ING4 e ING5, que unen DNA de doble hebra sin especificidad de secuencia, lo que junto a su unión a las colas trimetiladas de la histona H3 funcionaría como un punto de anclaje reforzado para complejos remodeladores de la cromatina. Tres mutaciones puntuales en el dominio N-terminal de ING5 han sido descritas en tumores primarios: Q33R, I68V, and C75R. El análisis estructural de estos mutantes revela que son dímeros con estructura helicoidal al igual que ING5. Sin embargo, I68V y C75R están fuertemente desestabilizados, lo que sugiere un posible papel en el desarrollo de cáncer. El efecto funcional que tiene la expresión en células NIH3T3 de estos mutantes ha sido analizado mediante diversas técnicas de Biología Celular, mostrando efectos en la sublocalización celular, en proliferación celular y en ciclo celular, siendo los mutantes I68V y C75R los más afectados.